Fluorescenza rossa in due fasi

Tutto è iniziato con un'osservazione fatta due anni fa dagli scienziati dell'ETH utilizzando una speciale proteina fluorescente, la Dendra 2, isolata dai coralli, che si illumina di verde. La luce può essere utilizzata per modificare la struttura molecolare della proteina in modo che cambi colore in rosso. I ricercatori hanno quindi trovato un secondo nuovo modo per ottenere questo cambiamento di colore: l'hanno prima eccitata brevemente con un impulso laser blu e poi l'hanno immediatamente illuminata con una luce vicina all'infrarosso. Questa commutazione di colore in due fasi può essere utilizzata nella microscopia a fluorescenza, ad esempio per visualizzare un punto tridimensionale precisamente definito in un tessuto, come una singola cellula (ETH News segnalato).

Un team internazionale di ricercatori guidato da Periklis Pantazis, professore presso il Dipartimento biosistemi e ingegneria dell'ETH di Zurigo a Basilea, ha ora chiarito questo meccanismo di cambiamento di colore in due fasi. Gli scienziati lo chiamano "conversione innescata". Le nuove conoscenze consentono ai ricercatori di modificare altre proteine che reagiscono alla luce in modo tale che anch'esse possano essere stimolate in due fasi.

Entro i millisecondi

I ricercatori dell'ETH di Zurigo, del Karlsruhe Institute of Technology e del Janelia Research 365体育直播_365体育投注-竞猜网投 di Ashburn, in Virginia, hanno esaminato in modo particolarmente dettagliato le proteine attivate con la luce blu. Sono riusciti a dimostrare che queste proteine si trovano in uno stato di eccitazione che dura diversi millisecondi. "? un tempo relativamente lungo", spiega Pantazis, "altri fenomeni di fluorescenza hanno una durata molto più breve".

Gli scienziati sono riusciti anche a dimostrare che questo stato è un fenomeno noto in chimica quantistica, il cosiddetto stato tripletto. Dopo circa cinque millisecondi, la proteina colorata Dendra 2 torna al suo stato fondamentale. La conversione innescata avviene solo se la seconda fase, l'illuminazione con luce vicino all'infrarosso, avviene entro la finestra temporale della tripletta.

Sequenze di amminoacidi alterate

La durata dello stato di tripletta dipende fortemente dalla stabilità della proteina colorata, che a sua volta dipende dall'esatta sequenza degli elementi costitutivi della proteina (gli amminoacidi). Gli scienziati hanno quindi modificato la sequenza di aminoacidi di Dendra 2 in diversi punti. Hanno fatto lo stesso con un'altra proteina fluorescente, Eos, che in precedenza non poteva essere stimolata in due fasi. Dalla letteratura scientifica si sapeva che questi siti sono centrali per lo stato tripletto.

Gli scienziati hanno misurato la durata dello stato di tripletta di tutte le nuove proteine. In alcune delle proteine testate, questo stato era significativamente prolungato. Gli scienziati sono stati anche in grado di modificare la proteina Eos in modo che potesse essere attivata in due fasi. Sono riusciti a fare lo stesso con altre sei proteine che in precedenza non potevano essere attivate in due fasi. "Le proteine modificate non solo sono commutabili in due fasi per la prima volta, ma sono anche più stabili e, di conseguenza, brillano di più", afferma Manuel Mohr, dottorando del gruppo di Pantazis e primo autore dello studio.

Possibile con qualsiasi microscopio

Gli scienziati hanno fatto la scoperta originale con un laser non commerciale. Hanno utilizzato una luce nella gamma del vicino infrarosso. Tuttavia, gli scienziati sono riusciti a dimostrare che l'effetto può essere ottenuto anche con i laser rossi disponibili in commercio, come quelli utilizzati in ogni microscopio a fluorescenza. Ciò significa che la "conversione innescata" è possibile con qualsiasi microscopio a fluorescenza.

La "conversione innescata" può essere utilizzata in microscopia per marcare un punto ben definito in un tessuto. A tale scopo, gli scienziati dirigono un raggio laser blu e uno rosso nel tessuto in modo che i raggi si incrocino in un punto. La conversione innescata avviene solo in questo punto di intersezione. "Poiché né la luce laser blu né quella rossa sono tossiche, il metodo è ideale per gli organismi viventi", spiega Pantazis. Sono ipotizzabili anche applicazioni ad altre tecniche di microscopia, tra cui la microscopia ad altissima risoluzione (microscopia a super-risoluzione), che esiste già da diversi anni.

Mappatura del cervello e sequenziamento genico

"Ora sappiamo come modificare le proteine fotoconvertibili in modo da poterle commutare in due fasi", afferma Pantazis. I ricercatori hanno brevettato questa conoscenza. Gli scienziati dell'ETH stanno lavorando con esperti di proteine per modificare di conseguenza altre proteine colorate utilizzate nella microscopia.

Recentemente, gli scienziati hanno modificato le proteine in modo che possano rilasciare una sostanza messaggera che attiva i geni in modo controllato dalla luce e in modo che l'attivazione della luce possa avvenire con due colori. I ricercatori potrebbero irradiare un tessuto con un laser in modo tale che un raggio blu e uno rosso si incrocino in un punto. In questo modo sarebbe possibile attivare in modo specifico i geni in una singola cellula del tessuto. Inoltre, anche le proteine che rilevano il calcio possono essere modificate di conseguenza. Queste potrebbero essere utilizzate nella mappatura 3D del cervello.

Infine, i biologi possono utilizzare la nuova tecnica per ulteriori analisi funzionali in 3D: L'ETH di Zurigo ha già concesso diverse licenze per il brevetto, tra cui una a una start-up che vuole sviluppare il sequenziamento del DNA in un sistema 3D.